载体构建实验总结

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所属分类:基因组学

     
 以前考研的时候就开始接触各种载体,构建的质粒也有几十种了吧,周期长短的都有,到现在在工作后,确实又积累了不少经验,想了想还是把经验写下来,一来做个记录,二来,或许能让大家少绕点弯路。
1. 前期工作
     
 俗话说用欲善其事,必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具,这样起的效果事半功倍。这里推荐大家两个工具,一个都知道,PRIMER5.0。另一个工具极强大,叫lasergene,也就是DNAStar包括设计引物到构建图谱一应俱全,图谱非常漂亮,而且分析酶切位点等等就超NB,如果感兴趣的话我可以給大家传一个图谱看看。
2. PCR
     
 如果没有现成的质粒可供酶切,PCR是最理想也是最方便的策略。关于PCR具体技术坛子内帖很多,我不多说了,这里仅在构建方面谈一谈。
如何设计引物?
首先,看懂质粒图谱!
     
 拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。想用N1质粒,设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉,不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白,你就死了;C1质粒,注意frame,要是移码了,你也死了。而且PEGFP系列有1、2、3,要弄清楚别弄窜了。一句话,要看懂你的图谱!再多一句,PEGFP的XBA1和Bcl1位点不能用。
     
 注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基(大家要用T载体就当我没说)。酶切位点设计也有一定的讲究,我的原则是,能用粘端就用粘端,实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶,如ECORV和SNAB1之类,要是以后还有别的用处就多加点酶切位点,我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到,注意计算TM的时候要减去这些不match的序列,
 或者选用touch-up策略。
     
 除了酶切位点,还要注意KOZAK序列的问题,很多质粒没有提供KOZAK序列,这要在设计的时候直接在引物上加好。
     
 GENE
OVERLAP也比较有用,比方说加个FLAG片段,HIS片段,2A序列之类的,直接设计三引物OVERLAP一下就可以,省得还要再多构建一步,这些都是设计引物时候就要考虑好的。
     
 引物长一点不要紧(我最喜欢两步法了),尤其是对GC比高的序列,有时候引物不长PCR根本不出结果,注意如果GC比较高,这个时候GENE
OVERLAP就不要做了,很麻烦,克隆很难挑。
没有合适的酶切位点?
     
 很简单,用同尾酶策略,比方说Bgl2和BamH1,Nhe1和spe1,Xho1和Sal1(注意连上了切不下来),实在不行就平端吧,只要不超过4KB,平端酶连接也不那么难。
如何选择Taq酶?
     
 选择Taq酶也很关键,首先,高保真(High fidelity)这是必须的,我在国内常用LA
KIT,可这边***忑贵,只好用(美)国货。常用的PFU,PHUSION和PFX。PFX50是invitrogen公司的,一度曾卖到脱销,保真性应该是目前最高的,是普通Taq的50倍,对一般基因绝无问题(我同事4.5K
PCR产物,居然一个突变都没有),但是对比较难PCR的高GC或者位点比较难做PCR的基因(基因组为模板)就明显不行了;PFU(安捷伦)保真性没有PFX50高,但是能力很强,略贵点;phusion是NEB公司的,不贵,但是这个酶很怪异,每次用都要把annealing温度调高好几度,否则就出杂带,个人觉得NEB内切酶绝对是NO.1,但是Taq就不如Invitrogen了,如果实验室有钱,直接买invitrogen的spuermix,什么都混好了,连ddH2o都搞定,只要直接向里加模版和引物就OK,每次我要拿漂亮的结果都用supermix。
     
 还是那句话,读说明书。同是高保真Taq酶,iproof
要求98度起始1min,pfx就要求95起始2min
,延伸有的是72,有的是68,有的要加1uL,有的加0.5,有的TM要低五度,有的高三度,这些必须要读说明书,读且仔细读,这是拿到任何试剂都要做的第一步。
如果基因太难PCR,怎么办?
     
 首先,DMSO是好物,好到甚至FISHER的Phusion就直接写上了DMSO这项,注意3%-6%,太高Taq酶活性就不行了。如果GC太高而且片段过长的话,DMSO也不行,GC低的不推荐。
     
 我做个过一个2.8k,GC比高达92%的基因PCR,一共做了两周,从保真性最强的PFX50到普通的promega
2xGO Taq都试过,什么DMSO,甘油,Biorad的iproof with high GC Buffer, NEB one
Taq 2x Taq High GC(还带Enhancer的),TAKARA
的LA都试过,都不行,要么不出带,要么就是乱七八糟的带一起来,头晕脑涨的我都打算抹平策略了,后来从别的实验室弄来一个clontech的2
GC rich
kit,一次搞定!强烈推荐这个KIT,太牛了,在别家都缴械的时候,它一锤定音,不过价格也比别家都牛,10次反应就130刀,其实实验室大可以备一个,就是防备超高GC又长的片段。不过这个KIT非高保真,送了三个克隆测序,各在不同部位有突变,于是我就从A克隆切一段接到B克隆上,又从C克隆切一段接B克隆上。注意的问题是:GC比太高测序也很困难,正常GC能测1K左右,到了High
GC就能测个五六百,这时要多准备些引物。
PCR产物的纯化
     
 如果带很单一,又强,直接PCR产物纯化就可以,如果有杂带,但目的带也很强,跑胶,目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈,就是回收率的问题,我试过很多家的KIT,promega的GEL回收试剂盒效率和价格都很合适,推荐这个。
     
 关于T载体,我在国内的时候是必用的,到了美帝反倒一次没用过,这边比较流行直接用PCR产物切,就是回收完了直接切上,回收后然后连接,这又回到了最开始设计,要加保护碱基。这个策略好处就是免除了T载体这步,直接插入目的载体,存在的问题就是处于盲做状态,还要加保护碱基。
3. 酶切
     
 我的原则一向是:尽量避免PCR,能酶切的多酶切,实在没办法才去PCR。
     
 这里强烈推荐NEB的内切酶,还记得在有一次用别家的酶切过夜,结果质粒都被切碎了(当然当时质粒浓度也不高),而用NEB的酶,切个七十二小时仍旧一切OK,尤其现在NEB还推出了HF的内切酶,没有星活性而且统一都用Buffer4,很好用,在国内我都用TAKARA的酶,基本上还可以。
     
 注意要读说明书,选用什么buffer,多少度,用不用加BSA,这些都要仔细读。
     
 酶切的起始量,PCR产物没甚么可说的,全都切上,如果是从质粒上切片段,要根据你片段大小,片段适中,比如说7kb质粒,有2KB是目的片段,这时切个3-4ug就足够了,如果只有0.2KB,那最好多切点,6ug-7ug 内切酶也没问题。
4. 连接
     
 最常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用,但是注意Buffer里有ATP,反复冻融ATP失活得很快,这时有两种办法,一种是象我们chair实验室,每次连接都统统朝里面加1uL
ATP;另一种是我们实验室的策略,拿到buffer就分装,10uL/管,一次性使用,哪怕就用1uL,剩下的直接扔掉。
     
 连接最重要的注意事项,1,载体总量,2.载体和插入片段比例,3.载体和插入片段质量。
     
 我在回收之后都要测载体浓度,一般来说,载体浓度在20-100ng/uL很好,太低的话碰撞几率低,太高的话又会产生很多非目的克隆,总量从50-100ng就可以,太低失败几率很高,太高克隆太多,挑克隆会很麻烦,反应总体积也有讲究,体积太大载体和目的片段碰撞几率太低,而且对感受态细胞也是个挑战,通用10-15uL,我试过25uL没有问题,40uL就不行了。
     
 载体和插入片段比例一般是1:3,如果很难连接,比如说平端连接,要适当提高载体浓度,同时加大比例1:10,我试过一端平一端粘连接,4kb片段,4KB载体,连接成功率相当高,10个克隆里8个都是阳性的,但是7KB片段,5KB载体的平端连接就连试两周都失败,最后换策略分两段先后克隆进去的,这也給了我很深教训,隔了一阵又做类似的实验,这回我干脆连试都没试,继续分成两段分别连进去的。
     
3片段连接同理,如果片段不太大,比方说小于3K,3片段连接成功几率很高,但是如果你片段太大,就不行了,我试过4K载体,4K片段A,2K片段B连接,失败四五次,最后还是绕路走了。
5. 转化
     
 这个简单,遵循基本的准则就行,话说实验室原来从sigma买感受态(competent
cell),后来发现还是自己做的效率高,尤其在使用XL-10细菌时比DH5a效率要高,需要的话我可以发protocol上来。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素,实验室原来有个volunteer,做一次失败一次,我就奇怪了,后来才发现他用的居然是加了KANA的LB,直接晕过去了。还有就是氯化钙的问题。氯化钙吸水性很强,吸水后就完蛋了,我一般把它放在干燥罐里(反正我也不知道啥名字,就那种玻璃罐,干燥用的),大家要不放心,用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。
6. 酶切鉴定
     
 普通实验做酶切鉴定,阳性率非常高,大多数情况下四个中起码有三个是正确的,很多时候都是百分百正确,这里推荐一种叫fast
digest的酶,切个十几分钟跑胶就行了。
     
 如果找不到合适的酶切位点或者有其他问题,比方说,有段时间我做个非常新潮的实验,初始步骤的虽然是蓝白筛选,但是白斑也大部分都不对,没办法鉴定就用菌液PCR,最夸张的一次是五十个白斑里面居然就一个阳性的(没办法,该实验特点),这要提质粒可提不起。菌液PCR也有讲究,很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多,为甚么?因为你PCR引物选的都在载体上,注意,引物必须分别在载体和插入片段上才准,PCR方法鉴定是极其准确的,我做过数百次菌液PCR,只要PCR条件正确,PCR和酶切结果绝对百分之百对得上。PCR鉴定做起来也很简单,拿个2mL
tube,装0.5mL
加入相应抗生素的LB,摇个三小时左后取1uL做模板就行了,楼下有个实验室的POSTDOC特喜欢做直接的菌落PCR,我没试过,效果怎样不好说。
     
 还要多说一句,要注意质粒是低拷贝还是高拷贝,普通的质粒一般4mL摇过夜,1.5mL就能提到500ng/uL 总体积40uL的质粒(根据试剂盒不同,最高提过800ng/uL,也试过200ng/ul,都正常)。如果是低拷贝质粒,象PET系列和pshuttle系列,都是低拷贝,能拿到100ng/uL就已经很好了,这时候需要4ML菌当2ML提,但是最要命的还是Adeasy
质粒(用来做腺病毒的),这个质粒超过30KB,普通KIT回收效率低到忍无可忍,一定要用特定的试剂盒才行,还是那句话,这些都要读说明书。
7. 测序
     
 我们拿到测序结果时候,不仅要核对具体的序列,而且要看测序图,这很重要,因为有时候光看结果对,实际上图显示的不对,或者虽然结果不对,但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信,出现突变也不怕,有很大可能性是简并密码子,还要重点检查的地方就是“接头”的地方,因为偶尔引物会出错,比方说少个碱基什么的,还有时候酶切之后连接也会丢一或者俩碱基什么的(这些问题我都碰到过),如果不仔细检查到了后期悔之无及。
     
 还要注意反向测序引物,尤其用到SV40,因为我用PEGFP这套质粒用习惯了,等换成大概是TET-ON那套系统,SV40正好是反过来的,我也没留神,结果测回来的是载体……又吃了一次教训。
     
 最后,希望我的一些个人体会能尽绵薄之力! 

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