蛋白组DIA分析:Spectronaut软件使用指南

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所属分类:生物信息学

官方文档:
0. 准备
Spectronaut软件是蛋白组DIA分析最常用的谱图解析软件之一,优点是定量准确,缺点是高额收费,window版本,速度慢。一起来简单了解下用法。

这是它的界面。只要理解了DIA流程,用法其实很简单,首先构建谱图库,或者导入已建好的DDA谱图库,再导入DIA原始文件,配置好参数,最后run即可。
一开始需要准备的是各种数据,包括:DIA的rawdata,DDA的rawdata,DDA的database(若有,需加入iRT序列进行校正),DDA的搜库鉴定结果。如果样本数多的话,这些原始文件会非常大,刚也提到该软件只支持windows系统,转移数据很麻烦,随便一个项目就能达到500G,所以必须要用很大的内存和硬盘。转移数据往往要花费很长时间。
1. 谱图库构建
首先进入Library,导入谱图库。Generate Library from Pulsar...是说用Spectronaut构建谱图库;Generate Spectral Library from...是说从别的搜库软件构建好的谱图库导入,支持常见的搜库软件结果文件:

Import/Exprot Spectral Library是导入导出谱图库,这里的谱图库是说已经在Spectronaut中完成了的库。
我们通常是自己导入搜库软件的结果文件来构建谱图库。
若导入MaxQuant构建的谱图库:
导入MaxQuant结果,只需指定combined文件夹导入,软件会自动关联相对应的原始数据(DDA的rawdata,关联也需要一段时间),若原始数据与搜库结果不在同一个文件夹内,可能会导致关联失败,可以通过“Assign Shotgun Files”的方式来指定相应的原始数据(见下图);关联后,在FASTA Files一栏选择相应的数据库文件(数据库要右击上传,然后点击左边倒三角);点击”Load”后加载Ion library,导入谱图库需要一段时间。

导入成功后,左边Spectral Libraries会显示出来。点击左侧spectral libraries的名字,更改为相应的项目编号;右侧显示的为spectral library的详细信息。

若导入Mascot结果作为谱图库:
Mascot的结果通常是dat文件,每一个rawdata对应一个dat。但是Spectronaut要求dat文件名与对应的raw文件同名,即使Assign shotgun files指定rawdata路径,也会关联不到,而且要将所有的dat构建一个谱图库(这是我们想要的)需要将不同的dat文件整合到同一目录下,实际上,一个样本往往多个fraction,同个样本的多个dat文件一般放在一个目录中,所以我们要拷贝出来,重命名。如果样本数多,也是件麻烦的事情。
比如原来每个样本的6个fraction是这样的结构:

最后需要在同级目录下同时存在:

然后导入全部dat文件,会自动关联对应的rawdata,上传数据库,设置参数即可构建谱图库了。
常见参数如下,一般默认就好。

另外还有一点,根据上传的数据库类型进行解析。主要是要注意fasta序列的ID及其后面的描述信息等,因为不同来源的数据库,规则会不同。

导入的数据库格式需要是fasta后缀,fa后缀会识别不了。对于蛋白组来说,大部分数据库类型都是uniprot(软件已经给你制定好了,无需定制),若是其他的类型,导入后,根据数据库制定规则,不会的可以点击后面的小问号,最后add rule。

import数据库后,记得打勾选中。

最后点击右下角的load,即导入谱图库,导库的过程可能需要话一段时间。构建谱图库的过程可以在日志文件中查看:

以下是完成后谱图库的信息:

2. DIA解析
旧版本可能是切换到“Review”界面,点击“Load Raw from File”后导入DIA数据。新的版本是Analysis界面,然后点击set up a DIA analysis from file,将DIA原始数据导入:

然后选择谱图库:

后面的参数默认就好,一步一步点击next。直到要设置condition实验设计这一步。需要注意的是圈出来的这几部分,对照组及重复设置。当然也可以设置好后导入。

设置condition和replicate的参数来判断是成对还是非成对,原则是:相同的实验对象Replicate编号一致,不同的实验对象Replicate编号务必不同。如下:

一直点到最后finish,然后一个数据一个数据的开始提峰。

数据量大的话,提峰很慢,因为要解卷积混合谱图。可能要默默等上个几天。
3. 结果导出
提峰完成后,首先是保存工程文件,以sne为后缀。注意是右击下面这个地方,然后save as:

Spectronaut一旦关闭,完成的结果便会丢失,通过保存工程文件,后续如有重新查看的需求,只需导入工程文件即可,无需重新运行spectronaut。
然后是结果的保存。切换到Report标签界面。

你的软件可能没有配置好的如下导出结果格式,这个主要是为后续定量分析的软件使用准备,如R包MSstat。

一般只有BGS factory report,这时需要自己设置格式。可以对columns进行选择,也可以filters过滤一些蛋白。当然你也可以全部选中,导出后再处理。
可以对新建立的格式做保存,下次就可以直接用啦。比如下面我对所有列都做了选中(打勾),再save as,命名,点ok:

最后,export report导出:

对于MSstats R包,需要导出2种格式文件,一是如下:

二是蛋白定量文件,导出并命名为PG_Report.xls:

当然也可以导入或导出制定好的格式,比如我导入:

不过有个小问题,貌似自己制定的和外部导入是由不同的,也就是说这个蓝色阴影和打勾效果不一样,导入的格式和BGS factory report似乎是同一级别的,而上面新建格式只是在BGS factory report的子文件而已。

根据导出的结果看,自己新建的好像不行(这里没有探究清楚)。
不论如何,我们导出结果。
最后的导出的文件包含如下,包含了工程文件、结果文件、参数及日志等:

重新导出结果
如果需要重新加载提峰的结果,可以在“Analysis”界面(旧版Review界面)选择“Load a spectronaut Experiment”,选择相应的sne文件进行加载。

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