为什么circRNA芯片比RNA-seq更适合于circRNA的表达分析?

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所属分类:生物信息学

RNA-seq检测circRNA表达面临很多挑战。circRNA在细胞内含量极低,约占线性RNA的5~10%(图1A),而测序能获得的作为鉴定circRNA的反向剪切位点reads的数据量则更低。(图1B)。事实上,在circRNA研究案例中即使提高测序深度及数据量,检测到的circRNA 反向剪切位点序列(junction reads)也微乎其微(图1c)。

  尽管测序获得的少量circRNA 反向剪切环化位点序列可以用于circRNA的鉴定,但远远低于对circRNA进行准确定量的数据量要求。对于表达差异的分析,至少需要几百个count才能满足定量误差小于20%(图2A)[2]。对一个典型的30M reads的RNA测序,只有不到5%的circRNA的检测值分布在可靠定量范围内(图2 B)。换句话说,大于 95%circRNA不能准确量化。另一方面,芯片检测精度不受转录本表达含量低的影响(图2C)[3],更适用于circRNA的表达研究。

为什么circRNA芯片比RNA-seq更适合于circRNA的表达分析?

图1(A)相比于mRNA, circRNA以及cirRNA junctions的丰度非常低。(B) Circular junction 序列仅占整个circRNA转录本的很小一部分(C) 以hsa_circ_0054254 为例展示不同组织样本中测序检测到cirRNA junctions的数目. Rybak2015,  Salzman2013

为什么circRNA芯片比RNA-seq更适合于circRNA的表达分析?

图2.(A)测序数据量与定量准确性的关系图 (B)可靠定量转录本的比例与测序深度关系图(C)测序和芯片检测转录本表达与错误率关系图,芯片准确度受表达丰度影响更小。

一般的RNA测序适用于对mRNA的检测,但不适合circRNA的表达谱研究(表1),circRNA 测序数据的分析需要序列比对、组装、特殊的算法进行数据库的分析,这些复杂的数据处理过程降低了数据的准确度、可靠性和可重复性。

Arraystar circRNA芯片使用针对circRNA junction 区域设计探针,通过去除线性转录本对circRNA进行富集,准确灵敏地捕获并定量circRNA。芯片杂交信号不受其他高峰度转录本的影响,单个细胞单拷贝的circRNA也能被检测。


综上,与测序相比,芯片是更加高效、简洁、准确的circRNA表达谱研究工具(表1)。Arraystar circRNA 芯片包含丰富的circRNA指标,完善的分析和详细的注释,更适合于客户进行circRNA研究。

表1. Arraystar circRNA microarrays vs. RNA-seq

Arraystar circRNA microarrays  RNA-seq
灵敏度高:可检测单细胞单拷贝的低表达 大部分circRNA的junction 序列数据量太少,不能准确定量circRNA表达,增加测序深度将大大提高测序成本。
准确性高:circRNA junction-specific 芯片探针保证检测的可信度 缺乏成熟的circRNA比对算法,准确性低、可靠性低
注释全面:芯片收录了完善的circRNA检测指标并提供充分的circRNA生物学功能注释 测序获得的circRNA 注释信息有一定局限性,数据库中没有收录的指标缺乏额外注释信息。
芯片对计算机的依赖性低 测序需要计算机具有大于1000X的数据储存

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