高灵敏度和高精确性的超级增强子lncRNA(SE-lncRNA)芯片标记方法

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所属分类:生物信息学

      超级增强子lncRNA(SE-lncRNA)一般具有稳定性差、半衰期短的特点。它们能以极低的拷贝数发挥顺式作用,激活靶基因的表达。比如,SE-lncRNA HOTTIP可激活HOXA基因簇,其在细胞中的平均拷贝数少于1。

      为了精确地检测这些瞬时、低水平的SE-lncRNA,Arraystar科学家开发了一套高效的线性扩增方法,能够为多聚腺苷化或非多聚腺苷化的转录本产生足量的荧光标记cRNA。在此过程中,将分别携带有T7聚合酶启动子序列的oligo(dT)和随机引物以优化后的比例进行混合,作为反转引物合成cDNA第一链,随后进行双链cDNA合成与PCR扩增。最后,由T7 RNA聚合酶进行体外转录,合成带有Cy3或Cy5标记的cRNA(下图)。

      该标记方法极大的增加了低丰度或降解RNA分子的cRNA产物,比传统方法提高了100多倍。

高灵敏度和高精确性的超级增强子lncRNA(SE-lncRNA)芯片标记方法

图释:Arraystar公司SE-lncRNA芯片cRNA标记流程。(1) cDNA第一链合成与5’接头退火。 以携带有T7聚合酶启动子序列的oligo(dT)和随机引物混合物为反转引物,合成cDNA第一链,并与5’接头退火,合成cDNA第二链。(2) PCR扩增。使用RT引物和5’接头序列对双链cDNA进行低循环数的PCR扩增。(3)体外转录和标记反义RNA (aRNA)。以Cy3或Cy5标记的核苷酸为底物,双链cDNA为模板,使用T7 RNA聚合酶进行体外转录,合成带有荧光标记的反义RNA。线性扩增保留了原始转录本的相对水平和完整序列,且无3’偏好性。

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