基因诊断的概念、常用技术与应用

  • A+
所属分类:生物信息学

基因诊断的概念

一、基本概念:

1.人类的绝大多数疾病都与基因有关,基因变异引起疾病两种类型:

①内源基因变异:由于先天遗传和后天内外环境因素的影响,人类的基因结构及表达的各个环节都可发生异常,从而导致疾病。分基因结构突变和表达异常。

②外源基因的入侵:各种病原体感染人体后,其特异的基因被带入人体并在体内增殖引起各种疾病。基因改变引起各种表型改变,从而引起疾病,从基因水平探测分析病因和疾病的发病机制,并采用针对性的手段矫正疾病是近年基础和临床的方向。

2.基因诊断:利用现代生物学和分子遗传学的技术方法,直接检测基因结构及表达水平是否正常,从而对疾病作出诊断的方法。

二、基因诊断的特点:

1.以基因做检查材料和检查目标针对性强;

2.分子杂交选用特定基因序列作探针,故特异性强;

3.分子杂交和PCR具有放大效应,故有较大的灵敏度;

4.适用性强,诊断范围广。

基因诊断的常用技术 

一、核酸分子杂交:

核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开,而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。杂交通常在一支持膜上进行,因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交(Southern blot hybridization )和RNA印迹杂交(Northern blot hybridization)。

(一)核酸分子杂交的基本过程:

①DNA或RNA的制备:将待测样品用一定方法提取DNA或RNA。

②制备探针;

③杂交;

④检测。

1.DNA或RNA的制备:将待测样品用一定方法提取DNA或RNA。

2.基因探针的概念:

① 基因探针(probe)就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列,它可以包括整个基因,也可以仅仅是/基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之转录而来的RNA。

② 探针的来源:

DNA探针根据其来源有3种:一种来自基因组中有关的基因本身,称为基因组探针(genomic probe);另一种是从相应的基因转录获得了mRNA,再通过逆转录得到的探针,称为cDNA探针(cDNA probe)。与基因组探针不同的是,cDNA探针不含有内含子序列。此外,还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段,称为寡核苷酸探针。

③ 探针的制备:

进行分子突变需要大量的探针拷贝,后者一般是通过分子克隆(molecular cloning)获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进,应先制备基因组文库,即把基因组DNA打断,或用限制性酶作不完全水解,得到许多大小不等的随机片段,将这些片段体外重组到运载体(噬菌体、质粒等)中去,再将后者转染适当的宿主细胞如大肠杆菌,这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑,通过原位杂交,从中可筛出含有目的基因片段的克隆,然后通过细胞扩增,制备出大量的探针。

为了制备cDNA 探针,首先需分离纯化相应mRNA,这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到,如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了 mRNA作模板后,在逆转录酶的作用下,就可以合成与之互补的DNA(即cDNA),cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序,但内含子已在加工过程中切除。

寡核苷酸探针是人工合成的,与已知基因DNA互补的,长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量,也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列,并用化学方法合成。

④ 探针的标记:

为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交,有必要对探针加以标记,以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32 P标记探针的某种核苷酸α磷酸基。但近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体,荧光素等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是缺口平移法(nick translation)。

  • 蛋白质组学业务咨询
  • 扫码咨询相关问题
  • weinxin
  • 代谢组学业务咨询
  • 扫码咨询相关问题
  • weinxin

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen: