杂交、扫描、图像分解对基因芯片实验的影响

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所属分类:生物信息学

1. 基因芯片杂交技术

基因芯片杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。当用于基因表达检测时,杂交需要高盐浓度、高样品浓度、低温和长时间(往往要求过夜),但严谨性要求则比较低,这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度[1]。

目前对于基因芯片的杂交影响因素研究报道不多,主要有以下几方面:

1)不同杂交时间的影响:如 Sarto[2]等研究了不同水平的探针浓度和杂交时间对基因芯片杂交的影响,研究发现增加杂交时间从 18小时到 42 小时和 66 小时,杂交质量明显改善,尤其是探针浓度低于理想浓度时,长时间杂交明显增加信噪比、差异表达基因数目和重复芯片的相关性。

2)杂交动力学的影响:如McQuain[3]等比较了静态杂交和动力杂交对基因芯片杂交的影响,结果发现动态杂交提高了杂交速度,增加了信噪比和减少了点与点之间的误差。

3)PCR 片断的长短及浓度的影响[4]:长的 PCR 片断比短的 PCR 片断获得更高的杂交信号,信号逐渐增强直到 500bp,最佳的点样浓度是 1ng/nl,太低的点样将导致太弱的杂交信号。

4)双链 DNA与单链 DNA的影响[5]:单链 DNA比双链 DNA更加敏感, 可能是因为单链有更多编码链可结合到标记的 cDNA 上。

5)杂交容量的影响[3]:较大的杂交容量是有利于杂交的,在有盖玻片的小容量内杂交可能会导致杂交液的蒸发,就可能产生很高的背景色,在较大的杂交容量杂交就可避免上述情况。

2. 基因芯片扫描

当生物芯片和样品探针杂交完毕后,就需要对杂交结果进行图像采集(荧光扫描)和分析。目前专用于荧光扫描的扫描仪根据原理不同大致分为两类:一是基于激光共聚焦显微镜原理的 PMT(Photo Multiplier Tube,光学倍增管)检测系统; 另一种是基于 CCD(charge-coupled devices,电荷偶合装置)摄像原理的检测系统[4]。

所有的扫描仪都会面临同样的一个问题,即如何将背景降低并提高待测样品的信号。影响扫描质量因素主要有两方面:一是杂交点的质量,如果玻璃片未经过表面化学处理,点样的样品在玻片上结合不牢固,且容易扩散,造成背景高,样品的荧光信号将减弱,干扰信号的读取。

此外样点的直径也对扫描结果的读取产生影响,如果点的直径大,荧光分子扩散的范围也大,则观察到的荧光强度相对较弱[6]。二是扫描仪的精度,精密的基因芯片扫描仪要求一个有大的扫描范围、高的扫描速度和多个窄带光谱,这样才可捕获高清晰度、多荧光影像[7]。

调整仪器灵敏度有两种:其一是改变激发光的强度;其二是改变光电倍增管的灵敏度。Lyng[8]等为了制定出合理的扫描程序,研究了不同扫描仪之间基因表达强度、光电倍增管电压和基因表达率之间的关系。结果所有的扫描仪显示有一个 200-50000有限的扫描强度,基因表达率与光电倍增管电压没有直接联系。

但是可用的扫描强度是远远低于光电倍增管的最大检测范围,当高强度扫描时杂交点的像数强度达到饱和,而芯片背景值则会增加,就会导致错误的杂交点与背景强度比值。作者还研究了一种算法来纠正这些杂交点的强度,从而加大扫描可用强度值范围。

建议先增加光电倍增管的电压避免弱杂交点信号在可用扫描强度之下,允许最强杂交点信号达到饱和,然后降低光电倍增管电压,这样获得图像的像数没有达到饱和,使用他们研究的算法就可通过上述两次扫描的图像获得可靠的数值。

此外基因芯片结果的波动性部分是因为每次扫描单张芯片得到的图像不是完全一致有关, 为了解决这类问题, Romualdi[9]等提出多次扫描芯片并进行图像整合, 并研制了能将一系列图像综合的软件。

他们的研究结果提示该方法能提高差异表达基因的检测率,增加图像的同质性,减少假阳性结果, 并用半定量的 RT-PCR 技术进行了验证。 此外若玻片上有灰尘或其它杂质如衣物纤维、皮屑、指纹等,也将影响扫描结果。

3. 图像分析

图像分析的基本过程是用网格对杂交点的信号进行分解, 接下来从每个网格中提取出真实的目的信号[10]。即定位、分解和信息提取。

3.1 定位过程

即确定杂交点在芯片上的位置,首先对cy3、cy5两张芯片扫描图进行叠加,再确定芯片上的每一个杂交点位置,通常可以使用软件自动化完成,但自动化可能引起图像的旋转、矩阵的偏斜等误差,人工干预可以提高定位的准确性。

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