图像的采集和分析

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所属分类:生物信息学

当生物芯片和样品探针杂交完毕后,就需要对杂交结果进行图象采集和分析。

一般膜芯片的杂交都用同位素p32、p33作标记,其信号的检测需通过传统的磷光成像系统来完成。而对于用荧光标记的玻璃芯片杂交后的检测,则需要用专门的荧光芯片扫描仪。

1. 磷感屏成像系统Cyclone Storage Phosphor System

Cyclone磷屏成像系统为美国Packard公司生产的第一台集高分辨率、高灵敏度和5个数量级的线性范围于一身的计算机控制数字化自动放射成像分析系统,由于其使用方便、快捷、自动化程度、分辨率、图像清晰度均很高,既可定位亦可定量,目前已广泛应用于核医药学、细胞与分子生物学、生物化学、药理学、基因工程学、药物代谢动力学、放射免疫及受体免疫等多方面实验研究,成为十分方便的有力工具。

其优异品质主要得益于Packard专利的激光技术和共聚焦成像系统。应用范围为我们前面介绍的DNA Macroarray以及Northern、Southern、Western Blot.,手工测序,放射性原位杂交等的同位素结果检测。使用Cyclon磷屏可以大大缩短研究周期,获得清晰的分辨率。

其工作原理在于:同位素标记的杂交结果在磷屏上曝光,曝光过程32P等核素核衰变同时发射β射线,首先激发磷屏上分子,使磷屏吸收能量分子发生氧化反应,以高能氧化态形式储存在磷屏分子中。

激光扫描磷屏,对于激发态高能氧化态磷屏分子发生还原反应,即从激发态回到基态时多余的能量以光子形式释放,从而在PMT捕获进行光电转换,磷屏分子回到还原态。计算机接受电信号,经处理形成屏幕图像,并进一步分析和定量。一般化学发光物质如荧光染料标记样品成像过程与放射性类似。

系统特点

放射性自显影成像系统。储存式磷屏根据不同样品厚度、射线能量有多种型号磷屏可供选择,磷屏可以多次重复使用。灵敏度较X光片高数十倍,可以检测最弱的信号。曝光时间可以缩短20倍以上。

快速成像,从对磷屏进行扫描到获得完整的的数字化图像,总共需要不到10min的时间,实时图像显示,同时立即报告分析结果。可对放射性位置和强度进行相关的定位、定量分析,宽达105的线性范围,定量准确。

不需胶片、暗室设备、冲洗底片,一步到位完成分析过程。可选配Ouant ArrayTM 软件,用于尼龙膜上同位素标计的Gene Array定量分析。

2. 荧光芯片扫描仪

由于杂交时产生序列重叠,会有成百上千的杂交点出现在图谱上,形成极为复杂的杂交图谱。序列重叠虽然可为每个碱基的正确读出提供足够的信息,可提高序列分析的可靠性,但同时信息处理量也大大增加了。

一般说来,这些图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成,而不是通过对比进行人工读谱。用计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。扫描一张10cm2的芯片大概需要2-6分种的时间。

目前专用于荧光扫描的扫描仪根据原理不同大致分为两类:一是激光共聚焦显微镜的原理, 是基于PMT(photomultiplier tube,光电倍增管)的检测系统(另文介绍);另一种是CCD(charge-coupled devices,电荷偶合装置)摄像原理检测光子。

CCD一次可成像很大面积的区域,而以PMT为基础的荧光扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描,因此或者需要激光头,或者需要目的芯片的机械运动来使激光扫到整个面积,这样就需要耗费较多的时间来扫描;

但是CCD有其缺点:目前性能最优越的CCD数字相机的成像面积只有16×12mm(像素为10μm),因此要达到整个芯片的面积20×60mm的话,需要数个数码相机同时工作,或者也可以以降低分辨率为代价来获得扫描精度不是很高的图像。

由于灵敏度和分辩率较低,比较适合临床诊断用。

生产商业化扫描仪的公司包括:Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic Microsystems公司、Axon Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片扫描检测系统中的领头产品。2000GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的软、硬件都得到进一步加强。

ScanArray利用其专利的激光共聚焦光学系统,通过计算机控制,对生物芯片的荧光杂交信号进行全自动的扫描采集,并通过分析软件对数据结果进行定量分析。

最高灵敏度高:<0.1荧光分子/μm

  扫描精度可从5μm-50μm分级调整

  全范围扫描时间仅需5分钟,快速方便

  多达十种检测滤光片,涵盖所有生物芯片荧光染料的检测,适用于多种荧光标记探针

  不同波长依次扫描避免交叉光污染

  扫描后的图像还需要进一步的处理,这要求一定的软件支持。现有的分析软件包括:Biodiscovery的ImaGene系列,Axon Instruments的GenePix系列,GSI的QuantArray等

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