果蝇基因组DNA的提取

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所属分类:生物信息学

一、实验目的

1. 掌握动物基因组DNA抽提的操作过程,了解DNA提取的意义;

2. 熟悉DNA提取的步骤和了解DNA定量的测量方法及电泳原理。

预备知识

核酸是重要的生物大分子之一,脱氧核糖核酸(DNA)是核酸的一种,DNA是绝大多数生物(除少数RNA病毒外)记录、存储、传递遗传信息的分子。

近年来,分子生物学技术迅速发展,在分子遗传学研究领域的诸多方面涉及到抽提基因组DNA的方法。DNA的提取是进行PCR扩增、Southern杂交、限制性片段长度多态性分析等实验的基础。

二、实验原理

使用消化缓冲液使DNA从细胞内释放出来,65度温育可以加速DNA溶解,酚——氯仿异戊醇抽提可以将蛋白质与DNA分离,冷的异丙醇沉淀DNA,70%的乙醇洗去DNA表面的残留有机溶剂。

三、实验材料

新鲜存活的果蝇或-20℃冻存1h的果蝇个体5~10个。

四、实验 仪器 及用具

器具:玻璃棒、烧杯、离心管、量筒、分析天平、水浴锅、台式高速离心机、4℃冰箱、长玻璃吸管、微量加样器、枪头、紫外分析仪、琼脂糖电泳装置。

五、药品和试剂

酚(Tris饱和酚)、氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris 碱、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙醇。 n溶液配制: n消化缓冲液:含100mM的Nacl,10mM Tris.cl(PH8.0), 25mM的EDTA(PH8.0), 0.5%的SDS。 nTE缓冲液(PH8.0):含10mM Tris.cl(PH8.0),1mM的EDTA(PH8.0)。

n电泳缓冲液TAE: n电泳缓冲液(50×TAE):取Tris24.2g ,冰醋酸 5.7ml,0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ,加蒸馏水至 100ml。1×TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。 n0.7%琼脂糖凝胶的配制:称取0.28g琼脂糖,加入40ml 1×TAE,于电炉上加热至沸腾,待凝胶冷却至50℃左右(手试微烫),加入3μl GoldViewTW荧光染料,混匀后将胶倒入插好梳子的制胶板上,冷却后备用。

六、实验步骤

1)取6只麻醉的果蝇(让乙醚挥发干净)放入1.5ml 离心管 中,加入消化缓冲液30μl,用200μl Tip枪头迅速捣碎。

2)补加消化缓冲液400μl,混匀,置65℃温浴30分钟每10分钟摇荡一次,以使样品被充分消化。

3)取出 离心管 加入400μl酚,400μl氯仿:异戊醇(24:1)的混合物,盖紧管盖,上下颠倒充分混匀,抽提样品5min,12000rpm离心5分钟。

4)小心吸取上清转移至新的离心管中。加入400μl异丙醇,轻轻混匀3min,此时可见白色线团状物质出现。

5)14000rpm离心10分钟,让线团状物质沉到管底或管壁,小心倒出液体。

6)用400μl 70%的乙醇洗涤沉淀,12000rpm离心5min,倒掉乙醇,倒置晾干至乙醇味道消失,沉淀用50μl TE 缓冲液溶解。

7)取5-8μl DNA溶液,与2μl上样buffer混合,然后上样于0.7%的琼脂糖凝胶上,120伏电压下电泳30min。

8)将琼脂糖凝胶置于紫外分析仪中观察DNA条带的亮度。

9)另外一部分DNA稀释后于核酸测定仪上测定DNA浓度和纯度。

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