酵母RNA的水解及其组成成分的鉴定

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所属分类:生物信息学

【目的和要求】

1. 了解从酵母中提取 RNA 的原理和方法。

2. 了解定性鉴定核酸的原理和方法。

【实验原理】

酵母含RNA 达2.67—10.0%,DNA 则少于0.03—0.516%。为此,提取RNA多以酵母为原料。 稀碱法使用稀碱(本实验用0.2% NaOH溶液)使酵母裂解,然后用酸中和, 除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 。由此得到的 RNA为变性的RNA,可用作制备核苷酸的原料。

用硫酸水解 RNA 后,可生成磷酸、戊糖和碱基,各成分用以下反应加以鉴定:

(1)磷酸与钼酸铵 试剂 作用可生成黄色磷钼酸铵 [(NH) 3 PO 4 ·12MoO 3 ]沉淀。

(2)核糖与地衣酚 试剂 作用呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物,而核糖无此反应。

(3)嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。

【实验试剂和器材】

(一)试剂

酵母粉,0.2%氢氧化钠,乙酸,95%乙醇,无水乙醚,10%硫酸,浓硝酸,0.1N 硝酸银,1N 氨水。

酸化乙醇:100ml 95%乙醇,加1ml浓盐酸,pH<5.4。

钼酸铵试剂:将2g钼酸铵溶解在100ml 10% 硫酸中。

地衣酚试剂:100ml浓盐酸加入100mg三氯化铁,摇匀,贮存备用,使用前加入476 mg地衣酚。

二苯胺试剂:将4g二苯胺溶于400ml冰醋酸中,再加入11ml浓硫酸(比重1.84)。若冰醋酸不纯,试剂呈兰色或绿色,则不能使用。

(二)器材

试管,试管架,移液管,滴管,烧杯,锥形瓶,表面皿,漏斗,量筒,三用水箱, 离心机 ,抽滤装置。

【实验方法】

(一)酵母 RNA 提取

称取4克干酵母粉,放入100毫升烧杯中,加入40毫升0.2%氢氧化钠。在沸水浴中加热30分钟,常搅拌。冷却后,3800rpm离心15分钟。取上清液,加30ml酸化乙醇,搅拌,静置5分钟。然后3000转离心15分钟。弃上清,保留沉淀,沉淀即为粗RNA。

(二)RNA 的水解

向 50ml 锥形瓶中加入 0.1-0.2 克粗酵母 RNA 和 10% H 2 SO 4 15ml 。沸水浴 20 分钟后,3800rpm离心5分钟,取上清液进行下列实验。

(三)组分鉴定

1. 磷酸的检验

取 2ml 上清液放入 1 支 试管 中加入 5 滴浓 HNO 3 和 1ml 钼酸铵试剂后,在沸水浴中加热,观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。

2. 戊糖的检验

取 2 支 试管 ,各加入 1ml 滤液,分别加入等体积的地衣酚试剂和二苯胺试剂,在沸 水浴 中加热10-15 分钟。比较两支 试管 的颜色,并解释。

3. 嘌呤碱基的检验

取 1 支 试管 , 加入 1ml 0.1N AgNO 3 溶液, 再逐滴加入 1N 氨水至沉淀消失。然后加入 1ml 滤液, 放置片刻,观察有无白色嘌呤银化物沉淀产生(见光变为红棕色)。

【注意事项】

1. 用乙醇、乙醚清洗RNA时应用玻棒小心搅动沉淀,抽干,可得白色RNA粉末。

2. 水解组分鉴定时,应将试管清洗干净,否则会影响现象的观察。

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