affymetrix芯片实验步骤-中文版

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所属分类:生物信息学

目 录

第一章 总 RNA 的纯化(RNeasy® Kit)............................. 3

第二章 由 RNA 合成双链DNA.............................................. 4

一、反转录合成第一链cDNA............................................ 4

二、反转录合成第二链cDNA............................................ 5

第三章 生物素标记 cRNA 合成............................................. 6

三、体外转录合成标记cRNA............................................ 6

四、aRNA 纯化.................................................................. 6

第四章 杂交、洗涤、染色、扫描芯片 .................................. 8

五、片断化........................................................................... 8

六、杂交............................................................................... 8

七、洗涤、染色和扫描....................................................... 9

第一章 总RNA的纯化(RNeasy® Kit)

通常在使用TRIzol法抽提组织总RNA时,因为方法的限制,造成总RNA的纯度降低,影响探针的标记和芯片杂交。所以需使用QIAGEN RNeasy Kit进一步的纯化。详细操作原理和方法见Rneasy Mini Protocol for RNA Cleanup。

1. 根据需纯化的样品数配制DNase I混合液,每个样品需要80 μL的DNase I混合液,按10 μL DNase I的储存液加入70 μL Buffer RDD配制。

2. 取经质检合格的总RNA≤100 μg溶解于100 μL RNase-free的水中,再加入350μL Buffer RLT并充分混匀

3. 加入250 μL无水乙醇,Tip头充分混匀。

4. 将共计700 μL含总RNA的溶液转入套在2 mL离心管内的RNeasy mini柱子内,8,000 g离心15~30 s,弃去滤过液。

5. 加350 μL Buffer RW1到离心柱内。盖上管盖,8,000 g离心15 s,弃去滤过液。

6. 直接加入DNase I混合液(80 μL)到离心柱膜上,室温放置15 min。

7. 加350 μL Buffer RW1到离心柱内。盖上管盖,8,000 g离心15 s,弃去滤过液。

8. 吸取500 μL Buffer PRE到RNeasy mini柱子内,8,000 g离心洗涤15 s,弃去滤过液,再用500 μL Buffer PRE在8,000 g离心洗涤2 min,弃去滤过液和2 mL套管,将RNeasy mini柱子转入一新的1.5 mL Eppendorf管中。

9. 吸取40 μL RNase free的水,≥8000 g离心洗脱1 min。

10. 重复步骤9一次。

11. 测定OD值(通常OD数值在1.8~2.1之间)

第二章由RNA合成双链DNA

一、反转录合成第一链 cDNA

1、准备Poly-A Control

按下表稀释Poly-A Control:

表1.1

起始总RNA量

连续稀释

加到样品中体积

1

2

3

4

50 ng

1:20

1:50

1:50

1:20

2 μL

100 ng

1:20

1:50

1:50

1:10

2 μL

250 ng

1:20

1:50

1:50

1:4

2 μL

500 ng

1:20

1:50

1:50

1:2

2 μL

2、准备总 RNA/Poly-A RNA Control混合液

在冰上按照下表准备总 RNA/Poly-A RNA Control混合液。

表1.2

Component

Volume

Total RNA Sample (50-500 ng)

variable

Diluted Poly-A RNA Controls (Fourth Dilution)

2 μL

Nuclease-free Water

variable

Total Volume

5 μL

3、准备第一链反应混合液

A、在冰上溶解一链反应试剂

B、在冰上按照下表准备第一链反应混合液。

表1.3

Component

Amount

First-Strand Buffer Mix

4 μL

First-Strand Enzyme Mix

1 μL

Total volume

5 μL

C、转移5 μL准备好的第一链反应混合液到反应管。

4、加RNA/Poly-A RNA Control混合液

A、转移5 μL准备好的RNA/Poly-A RNA Control混合液到已经分装好第一链反应混合液的反应管中,至总体积10 μL。

B、轻轻振荡混匀,低速离心收集反应液到管底。

5、运行反应

A、在PCR仪上运行42 oC 2 h。

B、反应后低速离心收集反应液到管底,放置冰上并立即进行第二链cDNA合成反应。

二、反转录合成第二链 cDNA

1、准备第二链反应混合液

A、在冰上按照下表准备第二链反应混合液:

表2.1

Component

Amount

Nuclease-free Water

13 μL

Second-Strand Buffer Mix

4 μL

Second-Strand Enzyme Mix

1 μL

Total volume

5 μL

B、轻轻振荡混匀,低速离心收集反应液到管底。

C、转移20 μL第二链反应混合液至(10 μL)cDNA样品管中,混匀,低速

离心收集反应液到管底。

2、运行反应

A、在PCR仪上运行16 oC 1 h,65 oC 10 min。

B、反应后低速离心收集反应液到管底,放置冰上并立即进行IVT。

第三章 生物素标记cRNA合成

三、体外转录合成标记 cRNA

1、准备IVT 混合液

A、在室温按照下表准备IVT 混合液。

表3.1

Component

Amount

IVT Biotin Label

4 μL

IVT Labeling Buffer

20 μL

IVT Enzyme Mix

6 μL

Total volume

30 μL

B、轻轻振荡混匀,低速离心收集反应液到管底。

C、转移30 μL IVT混合液至(30 μL)双链cDNA样品管中,混匀,低速离

心收集反应液到管底。

2、运行反应

A、在PCR仪上运行40 oC,时间长度依赖于起始RNA投入量,见下表。

表3.2

RNA Amount

IVT Incubation Time

50–250 ng

16 hours

100–500 ng

4 hours

3、立即纯化或-20 oC保存。

四、aRNA 纯化

提前在50~60 oC预热aRNA Elution Solution 10 min以上。

1、准备aRNA Binding混合液。

在室温按照下表准备aRNA Binding混合液。

表4.1

Component

Amount

RNA Binding Beads*

10 μL

aRNA Binding Buffer Concentrate

50 μL

2、加aRNA Binding混合液

A、加60 μL aRNA Binding混合液到每个样品。

B、转移样品到U型板。

C、用枪上下混匀几次。

3、aRNA Binding

A、加120 μL100%乙醇到每个样品。

B、用枪上下混匀几次。

C、轻轻振荡混匀,≥2 min。

4、RNA Binding磁珠收集

A、转移U型板到磁力架上放置约5 min。

B、小心吸取上清,丢弃,取下U型板。

5、洗涤磁珠

A、加100 μL aRNA Wash Solution到每个样品,振荡1 min。

B、转移U型板到磁力架上放置约5 min。

C、小心吸取上清,丢弃,取下U型板。

D、重复A-C一次。

E、剧烈振荡U型板1 min。

6、aRNA 洗脱

A、加50 μL预热的(50~60 oC)aRNA Elution Solution到每个样品中,从磁珠上洗脱下纯化后的aRNA。

B、剧烈振荡U型板3 min。检查磁珠是否全部混匀,如果没有,继续振荡至磁珠全部混匀。

C、转移U型板到磁力架上放置约5 min。

D、转移上清到一个新的Nuclease-free管中。

7、保存aRNA在-20 oC以下的温度或者放在冰上进行定量和片断化。

第四章 杂交、洗涤、染色、扫描芯片

五、片断化

1、准备aRNA片断化混合液。

表5.1

Component

49/64 Format

100 Format

169/400 Format

aRNA

15 μg (1 to 32 μL)

12 μg (1 to 24 μL)

7.5 μg (1 to 16 μL)

5x Array Fragmentation Buffer

8 μL

6 μL

4 μL

Nuclease-free Water

Variable (up to 40 μL final volume)

Variable (up to 30 μL final volume)

Variable (up to 20 μL final volume)

2、片断化反应。

A、94 oC反应35 min。

B、反应结束后立即放置冰上。

3、电泳检测片断化产物片段大小,约为35~200 nt。

4、立即进行杂交实验或冻存。

六、杂交

1、按照下表根据杂交芯片种类准备杂交液。

表6.1

Component

49 (Standard) / 64 Format

100 (Midi)

169 (Mini) / 400 (Micro)

Final Dilution

Fragmented and Labeled aRNA

12.5 μg (33.3 μL)

10 μg (26.7 μL)

5 μg (13.3 μ L)

0.05 μg/ μL

Control Oligonucleotide B2 (3 nM)

4.2 μL

3.3 μL

1.7 μL

50 pM

20X Hybridization Controls (bioB, bioC, bioD, cre)

12.5 μL

10 μL

5 μL

1.5, 5, 25, And 100 pM respectively

2X Hybridization Mix

125 μL

100 μL

50 μL

1X

DMSO

25 μL

20 μL

10 μL

10%

Nuclease-free Water

50 μL

40 μL

20 μL

Total Volume

250 μL

200 μL

100 μL

2、在室温平衡芯片。

3、99 oC加热杂交液5 min。

4、同时加适量(见表6.2)预杂交液到芯片。

表6.2

Array

Volume

49 Format (Standard)

200 μL

64 Format

200 μL

100 Format (Midi)

130 μL

169 Format (Mini)

80 μL

400 Format (Micro)

80 μL

5、芯片预热10 min。

6、杂交液99 oC加热后,45 oC放置5 min。

7、最大速度离心杂交液5 min。

8、加杂交液到芯片里,45 oC,60 rpm杂交16 h。

七、洗涤、染色和扫描

1、准备好洗涤工作站和扫描仪。

2、分别分装600 μL stain1,600 μL stain2,800 μL Array Holding Buffer,放置到洗涤工作站的相应位置。

3、选择相应的洗涤程序,按下软件开始洗涤染色按钮进行洗涤染色芯片。

4、芯片洗涤染色后放进扫描仪,按下软件开始扫描按钮进行扫描芯片。

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